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梯度基因扩增仪知识
广州市默菲仪器有限公司 / 2011-11-29

 

参与PCR反应的物质主要为五种:引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量:若使用设计粗糙的引物,产物将很少甚至没有;而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然,即使有了好的引物,依然需要进行反应条件的优化,比如调整Mg2+浓度,使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。
(1)引物长度
PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp,常用的是18~27bp,但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低,在酶反应温度时不能与模板很好的配对;引物过长时又会造成Tm值过高,超过酶反应的最适温度,还会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应,而且合成长引物还会大大增加合成费用。
(2)引物碱基构成
引物的G+C含量以40~60%为宜,过高或过低都不利于引发反应,上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
(3)引物二级结构
引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体,应控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补,因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性,引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构,也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大;影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外,与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。
(4)引物3’端序列
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的,而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多,通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补,尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现,这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态,从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基的ΔG。∆G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用3’端∆G值较低(绝对值不超过9),负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高。引物的3’端的∆G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
需要注意的是,如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
(5)引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点,应在后续方案设计完毕后确定,便于后期的克隆实验,特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。
(6)引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源,特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。
2.酶及其浓度
Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶,是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的。Taq DNA聚合酶是一个单亚基,分子量为94 000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力,5’-->3’的外切核酸酶活力,无3’-->5’的外切核酸酶活力,会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸(通常为A,故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体),在体外实验中,Taq DNA聚合酶的出错率为10-4~10-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
此酶具有以下特点:
(1)耐高温,在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上,在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%,而在95℃下反应2小时后为原来的40%。
(2)在热变性时不会被钝化,故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
(3)一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb,且特异性也较高。
PCR的广泛应用得益于此酶,目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶,有用于长片段扩增的酶,扩增长度极端可达40kb;有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶;还有针对不同实验对象的酶等。
一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u(总反应体积为50l时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCl的缓冲液将其pH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200mol/l,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂(酚与氯仿抽)抽提除去蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸,该核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/l,实验中模板浓度常常需要优化,一般可选择几个浓度梯度(浓度差以10倍为一个梯度)。在PCR反应中,过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
5.Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200mol/l时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚合酶均有相应的缓冲液,而Mg2+也已添加,如果特殊实验应采用无Mg2+的缓冲液,,在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。

 

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